PCR und andere molekulare Tests: Erklärungen der wichtigsten diagnostischen Technologien

Molekulare Tests sind essenziell für die moderne Diagnostik von Infektionskrankheiten und genetischen Störungen. Sie ermöglichen es, das genetische Material von Krankheitserregern oder die genetische Information in menschlichen Zellen zu identifizieren und zu analysieren. Zu den bekanntesten molekularen Tests gehört die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die oft als Goldstandard in der diagnostischen Mikrobiologie gilt. In diesem Artikel werden die wichtigsten molekularen diagnostischen Technologien, einschließlich der PCR, erklärt und ihre Anwendungen in der Medizin beleuchtet.

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Funktionsweise der PCR

Die PCR ist eine Technik zur Vervielfältigung (Amplifikation) spezifischer DNA-Sequenzen. Sie ermöglicht es, geringe Mengen an DNA in kürzester Zeit millionenfach zu vervielfältigen, sodass sie analysiert werden können.

• Denaturierung: Die doppelsträngige DNA wird bei hoher Temperatur (ca. 94-98°C) in Einzelstränge aufgespalten.
• Annealing: Bei niedrigeren Temperaturen (ca. 50-65°C) binden spezifische Primer an die Ziel-DNA-Sequenzen.
• Elongation: Eine hitzebeständige DNA-Polymerase (z.B. Taq-Polymerase) synthetisiert neue DNA-Stränge, indem sie Nukleotide an die Primer anfügt. Dieser Schritt erfolgt bei etwa 72°C.

Dieser Zyklus wird typischerweise 25-40 Mal wiederholt, was zu einer exponentiellen Vermehrung der Ziel-DNA führt.

Anwendungen der PCR

1. Infektionskrankheiten: Die PCR ist besonders nützlich zur Diagnose von Infektionskrankheiten wie COVID-19, HIV, Hepatitis und vielen anderen. Sie kann das genetische Material von Viren, Bakterien und anderen Pathogenen in Patientenproben nachweisen.
2. Genetische Störungen: Die PCR wird verwendet, um genetische Mutationen, Deletionen und andere genetische Anomalien zu identifizieren, die mit Erbkrankheiten in Verbindung stehen.
3. Onkologie: In der Krebsdiagnostik hilft die PCR bei der Identifizierung spezifischer genetischer Veränderungen in Tumorzellen, die für die Wahl der Therapie relevant sein können.

Quantitative PCR (qPCR)

Funktionsweise der qPCR

Die qPCR, auch Real-Time-PCR genannt, ermöglicht nicht nur die Amplifikation von DNA, sondern auch die gleichzeitige Quantifizierung der DNA-Menge. Dies wird durch fluoreszenzbasierte Detektionsmethoden erreicht, die es ermöglichen, die DNA-Menge in Echtzeit zu messen.

• Fluoreszenzfarbstoffe: Diese binden an die doppelsträngige DNA und erzeugen ein Signal, das während der Amplifikation detektiert wird.
• TaqMan-Sonden: Diese spezifischen Sonden sind mit einem Fluoreszenzfarbstoff und einem Quencher versehen. Bei der Elongation werden sie abgebaut, wodurch das Fluoreszenzsignal freigesetzt wird.

Anwendungen der qPCR

1. Virenlastbestimmung: Die qPCR wird verwendet, um die Menge an Viruspartikeln im Blut zu bestimmen, z.B. bei HIV- oder Hepatitis-Patienten.
2. Genexpressionsanalyse: Sie ermöglicht die Quantifizierung der Expression spezifischer Gene unter verschiedenen Bedingungen oder in verschiedenen Geweben.
3. Diagnostische Tests: qPCR ist eine Schlüsseltechnologie für COVID-19-Tests, da sie schnell und genau die Anwesenheit des SARS-CoV-2-Virus nachweisen kann.

Reverse-Transkriptase PCR (RT-PCR)

Funktionsweise der RT-PCR

Die RT-PCR wird verwendet, um RNA in DNA umzuschreiben und diese dann zu amplifizieren. Dies ist besonders nützlich für die Analyse von RNA-Viren oder die Untersuchung der Genexpression.

• Reverse Transkription: Eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (Reverse Transkriptase) wandelt RNA in komplementäre DNA (cDNA) um.
• PCR-Amplifikation: Die cDNA wird dann durch die herkömmliche PCR amplifiziert.

Anwendungen der RT-PCR

1. Virale RNA-Detektion: RT-PCR ist das Standardverfahren zur Diagnose von RNA-Viren wie SARS-CoV-2, Influenza und Hepatitis C.
2. Genexpressionsstudien: Die RT-PCR ermöglicht die Analyse der Expression von mRNA in Zellen und Geweben, was für die Forschung in den Bereichen Onkologie, Immunologie und Entwicklungsbiologie von großer Bedeutung ist.

Digital Droplet PCR (ddPCR)

Funktionsweise der ddPCR

Die ddPCR ist eine hochpräzise Methode zur Quantifizierung von DNA- und RNA-Molekülen. Sie teilt die Probe in Tausende von Tröpfchen auf, wobei jede Tröpfchen einen separaten PCR-Reaktionsraum darstellt.

• Partitionierung: Die Probe wird in viele kleine Tröpfchen aufgeteilt, die jeweils eine PCR-Reaktion durchlaufen.
• PCR-Amplifikation: Die PCR wird in jedem Tröpfchen separat durchgeführt.
• Fluoreszenzanalyse: Nach der PCR wird die Anzahl der positiven und negativen Tröpfchen gezählt, um die absolute Menge der Ziel-DNA zu quantifizieren.

Anwendungen der ddPCR

1. Kopienzahlvariationen: Die ddPCR ist besonders nützlich zur genauen Bestimmung von Genkopienzahlvariationen, die in der Onkologie und Genetik wichtig sind.
2. Seltene Mutationen: Sie kann seltene genetische Mutationen in einer großen Hintergrundpopulation von Wildtyp-Genen nachweisen.
3. Virale Last: Die ddPCR bietet eine präzise Quantifizierung der viralen Last bei Patienten, was wichtig für die Überwachung und Behandlung von chronischen Virusinfektionen ist.

Isothermale Amplifikationstechniken

Funktionsweise der isothermalen Amplifikation

Im Gegensatz zur PCR, die Temperaturzyklen benötigt, erfolgt die isothermale Amplifikation bei konstanter Temperatur. Zu den bekanntesten Methoden gehören die Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) und die Recombinase Polymerase Amplification (RPA).

• LAMP: Diese Technik verwendet spezielle Primer und eine DNA-Polymerase, um DNA bei einer konstanten Temperatur von etwa 60-65°C zu amplifizieren.
• RPA: Diese Methode nutzt Recombinase, DNA-Polymerase und Einzelstrang-bindende Proteine, um DNA bei Raumtemperatur zu amplifizieren.

Anwendungen der isothermalen Amplifikation

1. Schnelle Diagnose: Isothermale Amplifikationstechniken sind besonders für den Einsatz in ressourcenarmen Umgebungen geeignet, da sie keine teuren Thermocycler erfordern.
2. Point-of-Care-Tests: Diese Methoden sind ideal für schnelle und einfache Tests am Point-of-Care, wie z.B. in Notaufnahmen oder abgelegenen Gesundheitszentren.
3. Infektionskrankheiten: LAMP und RPA werden zur Diagnose verschiedener Infektionskrankheiten wie Malaria, Tuberkulose und COVID-19 eingesetzt.

Fazit

Molekulare Tests, einschließlich PCR und ihrer zahlreichen Varianten, sind entscheidende Werkzeuge in der modernen Diagnostik. Sie bieten hochspezifische und empfindliche Methoden zur Identifizierung und Quantifizierung von Krankheitserregern und genetischen Anomalien. Durch kontinuierliche technologische Fortschritte werden diese Tests immer zugänglicher und vielseitiger, was ihre Anwendung in der klinischen Praxis und Forschung weiter vorantreibt.